研 究 方 法
患者队列
1318名符合PID诊断标准的患者接受了WGS检测。该队列包括散发和家族性PID患者（n = 974）及其家庭成员。在这些患者中，886例属于索引病例，是欧洲免疫缺陷学会（ESID）注册中心用于诊断分类的代表案例。这些患者主要原发疾病为散发性抗体缺陷PID（AD-PID）：均有复发性感染，28％的患者有自身免疫表现，8％的患者有恶性肿瘤。
研究路径
研 究 结 果
WGS鉴定已知基因的致病变异
根据美国医学遗传学学会指南（ACMG）筛选标准，在91个病例中鉴定了104个致病或可能致病变异（10.3％），涉及41个PID基因（图1）。研究鉴定了其中60名患者（6.8％）携带修饰基因TNFRSF13B（或TACI）致病性变异。因此，已知PID基因突变的阳性率是17.0％（151例）。
值得注意的是，5名诊断PID单基因（分别为BTK，LRBA，MAGT1，RAG2，或SMARCAL1）突变致病的患者同时携带TNFRSF13B变异。所有的变异中，69个（67.0％）为新发现的，而8个是染色体结构变异（SV），包括单个外显子的缺失和启动子的非编码区，这些变异通过全外显子组测序（WES）通常可能被漏检。
图 1 鉴定的PID相关基因编码区变异类型与患者临床特征。
WGS发现新的STAT1功能获得性变异表型谱
该队列中部分患者（22例）临床表现与既往基因相关的表型不符。例如慢性粘膜皮肤念珠菌病（CMC），由STAT1的功能获得性变异（GOF）引起，在98％的报告病例中都存在，而该研究发现携带STAT1 GOF的患者表现出如单一抗体缺乏症类似的多样化表型。这显示出基于队列的WGS PID诊断方法可以避免预设的基因型-表型关联对变异分析的干扰。
WGS鉴定PID基因非编码区转录调控因子变异
作者将罕见变异和大片段缺失（> 50bp）与使用启动子捕获Hi-C（pcHi-C）得到的组织特异性顺式调控元件（CRE）数据相结合，并优先考虑PID致病基因。分析得到22,296个候选的杂合性CRE缺失，通过次要等位基因频率（MAF）、功能评分和已知的PID基因过滤后，得到10个导致PID的CRE缺失，并对LRBA和DOCK8基因的杂合性CRE缺失进行了功能验证。该研究CRE致病性的发现，是PID的发病机制和诊断的重大进展。
图 2 LRBA和DOCK8基因的杂合性CRE缺失。
罕见变异关联分析鉴定新的PID致病基因
此外，通过队列WGS分析明确了以往报导的PID相关候选基因NFKB1和ARPC1B，并对后者进行了功能验证（图4）。
图 4 对WGS鉴定的PID相关基因ARPC1B进行功能验证。a. 发现的非编码区变异；b. 多个子女患病的ARPC1B变异家系; c. Western blot；d. 细胞免疫荧光示质膜及细胞内ARPC1B表达均下调。
常见变异关联分析揭示PID相关的基因组位点
PID的不同临床表型和家系内患病成员的不同外显率可以归因于分子遗传，也可能是由于随机事件（例如病原体传播）所导致。因此，作者对733例AD-PID患者与9,225个无关对照病例进行了常见单核苷酸多态性（MAF> 0.05）的全基因组关联研究（GWAS），用以解释以往所认为的AD-PID表型异质性。然后，通过先前对CVID的ImmunoChip研究（778个病例 vs 10,999个对照），对该AD-PID队列的GWAS数据进行了特定表型的荟萃分析。
该项分析再次明确了主要组织相容性复合体（MHC）位点和16p13.13区域与PID的已知关联，并且提示包括EOMES启动子区域在内的18p11.21和PTPN2附近的3p24.1与AD-PID的关联；通过中频（0.005<MAF<0.05）SNP关联分析，发现TNFRSF13B p.Cys104Arg与AD-PID的显著关联；通过条件分析，显示MHC I类和II类区域存在独立的AD-PID相关变异，这些变异可定位到HLA-B和HLA-DRB1基因上（图5）。
更进一步地，该研究发现了非MHC的AD-PID关联基因在其他9种疾病中有富集，提示WGS对共同信号通路分子变异的鉴定，有助于解释这些疾病和PID的易感性。
图 5 GWAS对AD-PID患者常见变异的分析揭示PID易感性，并提示新的候选PID致病基因。
WGS-GWAS用以鉴定PID单基因
利用数据驱动的pcHiC多功能基因评分（COGS）方法，GWAS能够用以探索由AD-PID或其他免疫介导疾病的表型关联位点是否可用于对候选PID单基因进行优先级排序。研究者在一种或多种疾病中选择了六个优先级得分高于平均水平的编码基因（图5），并在ETS1，SOCS1和PTPN2中均鉴定了截断突变，而所有这些变异仅在PID患者中发现。着重地，作者通过基因功能的回顾和分析，用SOCS1和PTPN2变异为例探讨了常见变异和罕见变异的相互作用对可变表型、以及表达定量性状基因座（eQTL）对同一家系中不同患者外显率的影响，也说明了队列WGS方法在PID诊断中的优势。
结 语
该研究通过在1,318名参与者的大型PID队列中进行了全基因组测序，并对其中886例的基因组编码区进行分析后发现，10.3％的患者发现了已知的PID单基因致病突变；研究者利用贝叶斯统计工具确定了多个PID相关新候选基因，并验证了新致病基因IVNS1ABP。而且，研究发现非编码转录调控区域的缺失是PID病因之一。
很明显，该研究展示了基于队列的WGS是PID研究的强大工具，不但可用于诊断已知的遗传缺陷，并且能用于发现与疾病相关的新的编码/非编码变异。其中，改进的分析方法和更好地整合进行平行分析的数据集（例如GWAS分析中细胞表面或代谢免疫表型），能将研究的范围扩展到非编码区域，从而提高诊断率。
通过这些改进或新的分析方法，有望改变我们对PID和相关免疫介导条件下基因型-表型关系的理解，甚至可能对免疫缺陷的临床定义进行重新界定、加深我们对人类免疫学的理解，并最终改善患者的预后。
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参考文献：Thaventhiran JED, Lango Allen H, Burren OS, et al. Whole-genome sequencing of a sporadic primary immunodeficiency cohort [published correction appears in Nature. 2020 Jul 17;:]. Nature. 2020;583(7814):90-95. doi:10.1038/s41586-020-2265-1