导读：染色体微阵列（CMA）或拷贝数变异测序（CNVseq）长期以来被用于识别智力障碍/发育迟缓（ID/DD）。近几年，随着全外显子组测序（WES）通量高和成本效益的优势凸显，临床已经越来越多的将WES作为遗传病诊断的主要检测手段。值得注意的是，尽管单独的WES或者WES联合CMA/CNVseq能够有效检测单核苷酸变异（SNV），小的插入缺失（INDEL）和拷贝数变异（CNV），但仍会遗漏某些类型的变体，例如微小CNV，染色体倒位易位和短串联重复序列（STR）等。如何解决这些容易被遗漏的变异将是进一步提高诊断率的关键，本文分享的研究正好回应了这个问题。
Genome Medicine（IF：10.88）近期发表的一篇重磅研究中，将全基因组测序（WGS）作为ID/DD诊断的一线检测方案，并将CMA/MLPA等其他方法检测结果作为对照，结果显示出了WGS非常强大的覆盖多种遗传变异类型的能力，包括SNV，INDEL，CNV，染色体易位，STR，以及单亲二倍体（UPD）等。
研究方法
病例分组：
队列1：68个患者，前期经CMA或MLPA共检测到3个三倍体与79个CNV，组成已验证队列；
队列2：156名疑似神经肌肉疾病/结蹄组织疾病/不明原因综合征/骨骼发育不良的单基因病患者，组成疑似单基因病患者队列；
队列3：2017年前100名临床提交做过CMA，且未被1、2队列选择入组的患者，组成前瞻性队列。
表1 三组队列的临床参数。NDD 神经发育障碍，NDD+ 神经发育障碍综合征，CTD 结缔组织疾病
实验方法：
30X WGS，CMA/MLPA/Sanger/PCR/FISH等其他对照实验。
图 三组队列研究路径。
研究结果
队列1：WGS能非常可靠地识别染色体缺失/重复及非整倍体，并揭示额外的临床相关的遗传信息
前期通过CMA或MLPA检测发现的79个CNV（54个缺失，25个重复）和3个三倍体，WGS均发现了上述变异，中位数为850 kb(最小为500bp，最大为155Mb)，同时WGS还发现了CMA及MLPA均未发现的更为复杂的重排变异，其中包括染色体的易位变异。
图 A. WGS检测CNV的分布图，紫色为缺失，黑色为重复，淡紫色为非整倍体；B.CMA显示一处9.3Mb的杂合缺失（仅显示有异常，但不知道为什么异常）；C.WGS显示9.3Mb缺失部分是Chr4与Chr7易位导致的缺失。
队列2：单基因罕见病中使用WGS-SV可提高诊断率
156例患者基于WGS-SV分析，共确定12种临床相关的SV：8个缺失，2个重复，1个倒位和1个复杂重排，WGS-SV将诊断率提高了8%。另外，WGS发现一个严重的癫痫发作患者是由复杂DEL-INV-DEL重排的SV引起。
图 B. array-CGH证实的DEL-INV-DEL重排；C. 为断点连接序列，在这两个连接中分别有38 bp和59 bp的插入(粉红色)。大部分插入是由重排所涉及的序列模板化的(下划线)，这暗示了复制错误是形成的潜在机制。
队列3：连续100例检测过CMA的患者进行WGS综合分析的前瞻性研究
1. WGS覆盖SNV/INDEL/CNV/SV：WGS分析出887个与智力障碍相关的基因中大型SV（>10Kb），小型SV（>2Kb）以及SNV和Indel等数据。对于CNV，CMA结果全部得到WGS再次验证，同时WGS-SV还额外发现C120rf65基因exon 2中3.7Kb纯合缺失并确认为常染色体隐性痉挛性截瘫55型，并且指出CMA的漏检是由于捕获探针范围不足导致的。
2. WGS检出CMA无法检测的小型变异：综合比较CMA与WGS-SV在CNV的检测能力，CMA检测数的中位数为22，检测变异大小的中位数为51Kb；而WGS检测数量为28，检测变异大小为17Kb。
3. WGS检出复杂染色体畸变：100名智力障碍患者在CMA中有3名携带染色体畸变尚未查出，而WGS检出且解释了其复杂机制。
图 A. 案例一发生染色体非平衡易位，WGS数据中可见到，在端粒序列前的81 kb重复片段(绿色)直接插入2号染色体的p臂，而2号染色体上有27 kb（橙色）的缺失。虚线表示从4号染色体到2号染色体的连接断点。右图，通过核型分析显示插入性重复重排，红色箭头表示2号染色体的衍生物；B. Chr3的2.23 Mb重复片段插入到Chr13，而Chr13上与插入的2.23Mb重复片段相邻的69.6Kb片段发生了倒置，此案例一共出现3个连接断点，机制十分复杂。右图，在核型上指出了插入和倒置的信号区域；C. Chr18呈环形变异，右图为核型。strong>
4. WGS检出STR：在WGS检测到的17个基因的STRs中，患者RD_P431中发现了ATXN7中可能的致病性重复扩增，利用TIDDIT和ExpansionHunter发现ATXN7基因座信号异常，并通过PCR确认了存在CAG STR变异，WGS检测到先证者CAG重复233次，父亲重复46次，确诊为脊髓小脑共济失调7型，临床表型符合。
图 A. 家系图及每个患者的ATXN7 CAG重复数；B. 来自父亲的PCR扩增的CAG重复数据显示了一个正常大小的等位基因和一个扩展的等位基因（顶部色谱图）。在底部色谱图中，显示了受影响儿童的结果；C. IGV截图显示了ATXN7异常。
5. WGS检出UPD：一例患者曾通过甲基化特异性MPLA验证了15q11.2q13区甲基化模型，与小胖威利综合征诊断相符。先证者与母亲Chr15出现22.9Mb-33.7Mb区域存在母源性UPD。在WGS数据中，Chr15的SNP等位基因频率可以直接实现对节段性UPD的识别。
结 语
总的来说，上述研究数据表明WGS对三个队列检出了所有其他检测方法均检出的变异，且还发现更为复杂的结构变异（如图）。WGS不仅可以捕获SNV，在检测致病性CNV方面表现优异，而且具有对STR，长纯合区段（ROH）和染色体重排的检测潜力。
图 变异类型以颜色表示(UPD，红色; 重复扩增,橙色 ;纯合缺失，浅绿色; 杂合缺失，深绿色; 重复,紫色; 复合杂合SNV，淡蓝色; 纯合子SNV,蓝色; 杂合子SNV，深蓝色; *表示复杂型; ¤表示WGS发现的CNVs。目前的研究中除了针对特定重复序列扩增和目标区域UPD仍需二次验证外，WGS有可能成为检测罕见疾病的许多不同遗传变异类型的单一检测方法，而不是执行两次单独的分析来检测SV和SNV，例如CMA联合WES。
需要记住的是，具体到每种变异类别（SV，SNV，STR，ROH和嵌合体识别等），了解WGS本身的局限性也很重要，对于SNV/INDEL/CNV的识别，WGS已经显示出高灵敏度和特异性，但是SV，STR和ROH分析都需要在更大的队列中进一步研究。
不管怎样，即使需要进一步的研究来充分理解WGS的局限性以及如何解释正常结果，对于应用WGS进行SNV/CNV分析的临床诊断而言，挖掘数据以寻找其他类型的致病变异带来的附加价值也非常高。
参考文献：Lindstrand A, Eisfeldt J, Pettersson M, et al. From cytogenetics to cytogenomics: whole-genome sequencing as a first-line test comprehensively captures the diverse spectrum of disease-causing genetic variation underlying intellectual disability. Genome Med. 2019;11(1):68. Published 2019 Nov 7. doi:10.1186/s13073-019-0675-1