串联DNA重复序列（Tandem DNA Repeats, TDR）在每个基序的大小和序列上有所不同。当扩增时，这些串联DNA重复序列已知与40多种单基因疾病相关，然而TDR与复杂遗传学疾病的关系，及其异质性的程度，尚不清楚。
最近，NATURE杂志发表的一篇文章对此进行了探究，加拿大多伦多儿童医院应用基因组学中心的遗传学及基因组学专家Ryan K. C. Yuen及其团队，基于全基因组测序数据对自闭症谱系疾病（Autism Spectrum Disorder, ASD）相关的TDR进行了研究（原文请点击左下方“阅读原文”）。
研究发现
TDR除了存在大小和基序的多态性，以及与基因组脆性位点的相关性之外，还发现：
- 对照群体中罕见的2,588种TDR扩增，在ASD患者中比非ASD同胞更为常见，其特点是多位于基因外显子及近剪接位点，且所影响的基因与神经、心血管系统或肌肉组织的发育相关；
- ASD患儿与非ASD儿童相比，罕见TDR发生扩增的比例较高（23.3％ vs. 20.7％），研究者估算其对ASD风险的总体贡献为2.6％；
- 研究揭示了几个与ASD相关的未知的TDR扩增基因，例如DMPK和FXN（详见下文表1），以及首次发现的TDR位点，例如FGF14和CACNB1基因TDR；
- 这些扩增的罕见TDR与较低的智商和适应性行为能力可能相关。
研究方法
作者调查了17,231个样本（包含ASD和对照群体）全基因组的串联重复序列数据，对这些TDR进行总览，包括染色体分布、基因功能区和非功能区/基因间区域的分类、以及基序的序列特征等方面。挑选符合2-20个碱基对长度的TDR，接着以1KG数据库人群频率≤0.1%为过滤条件，筛选出2588个罕见TDR，并对ASD患者中特有的罕见TDR扩增进行鉴定（图1）。最后，对这些筛选的TDR进行功能分析，揭示其与ASD发病机制的关联性。
▲ 图1a TDR检测和分析的工作流程示意图
▲ 图1b 每个分析队列的基因组测序数据来源
研究结果
TDR的异常扩增可能引起转录异常
研究共定位了31,793个TDR区域以及它们的染色体分布（图2a）。这些TDR较多地分布在基因5’UTR及上游（图2d），表明可能对基因的转录起调控作用。经与以往已知TDR区域进行比对，在ASD患者中发现新的、与脆性位点重叠的TDR区域，是以往没有记录的（图2e），其中脆性位点FRA19B重叠区域监测出2个不同扩增长度的TDR（图2f）。总之，一些ASD患者中，新发现的TDR与基因组脆性位点有重叠的现象，表明这些TDR的异常扩增可能引起一系列、大规模的转录事件。
▲ 图2 串联重复的基因组分析
a. Circos图，显示（从外到内）具有串联重复序列的31,793个区域，已知的简单序列重复区域，序列保守性，GC含量和已知的易碎位点的基因组分布。b. 检测到的串联重复序列的核苷酸组成。c. 检测到串联重复序列的重复单元（基序）大小的分布。d. 被检测到的串联重复重叠的基因特征的比例。e. 串联重复序列与a中显示的不同基因组特征之间的相关性分析，包括两种不同的序列保守性度量。f. 在检测到的串联重复中验证可变大小。
ASD候选TDR主要存在于常染色体基因序列区
TDR异常扩增是其致病的主要机制，而在ASD患者中检出的罕见TDR发生的扩增，则可能与ASD发病更为相关。通过对罕见TDR扩增的功能区域分析（图3a示更多地分布于基因功能区域，即非基因间区域），且在外显子及剪接位点附近相对高频（图3c）并倾向于分布在转录起始位点和剪接位点上（图3d、e），以及ASD患者罕见TDR的长度与正常家属相较有扩增趋势（图3b）。
这些都表明罕见TDR与基因表达相关，其扩增在ASD患者中有特异性。通过初步的信号通路分析，这些罕见TDR多与神经系统及心血管系统、肌肉组织发育相关。
此外文章提到，当加入X染色体进行TDR分析，ASD患者与其正常同胞间没有差异，表明所发现的ASD候选TDR主要存在于常染色体基因序列区。
▲ 图3 罕见的串联重复序列扩增的功能区域分析
a. 所有稀有扩展，基因间稀有扩展和基因稀有扩展的负担比较。b. 先证者，其父母和没有ASD的兄弟姐妹中重复序列的长度分布，其中先证者具有罕见的串联重复序列扩展。c. 不同基因组特征中的罕见串联重复扩增负担。d-e. 所有检测到的串联重复序列和已知的简单序列重复序列到最近的转录起始位点（d）和最近的剪接点（e）的距离。f. 针对DMPK中靶向串联重复序列的Southern印迹实验。g. 对影响基因组中基因的罕见串联重复序列扩增数目的基因组负担分析，将ASD患者与没有ASD的同胞进行比较。
罕见TDR扩增主要与智力水平和适应能力相关
该研究主要发现（图4）：与ASD相关的罕见TDR扩增在不同性别中的差异不显著，这与ASD在男性中的发病率较高不同，显示了罕见TDR扩增在ASD发病中的流行病学特征。在具体ASD表型中，罕见TDR扩增主要与智力水平和适应性行为能力相关，这与ASD的主要表型相一致。
▲ 图4 ASD患者罕见TDR扩增的临床分析
a. 女性和男性具有罕见的串联重复扩增的样本的比值（Fisher精确检验）。 比值>1表示女性罕见TDR扩增的比率较高，误差线显示95％置信区间。b. 智商和Vineland适应行为标准得分的比较，拥有罕见TDR扩增（n=139个人的IQ得分和n=310拥有Vineland得分）的患者组，和没有罕见TDR扩增（n = 426智商得分的个人，n=803拥有Vineland得分）的对照组（单向Wilcoxon测试）。最小值和最大值表示距中位数的3倍四分位数范围偏离的分数，而中心表示分数百分位数的中位数。
鉴定出ASD相关的候选串联重复区域
该研究最后列出了10个ASD最相关的候选TDR（经Sanger测序/RP-PCR/Southern印迹等实验验证，表1）。其中，位于CACNB1和MYOCD基因上的TDR扩增发现，提示了全新的基因-疾病关联，而FXN、FGF14、CDON和IGF1，因ASD相关TDR的发现，提示了潜在的基因型-ASD关联。最后，值得一提的是，无论是已知或新的疾病关联基因，这些TDR均位于非编码区，这暗示了以往基于捕获的基因检测技术的局限性，可能是未能发现ASD相关基因的原因。
▲ 表1 本文发现的10个ASD相关的候选短串联重复序列
该研究表明，TDR扩增是ASD的复杂遗传病因之一，并且与表型异质性相关。随着临床基因检测技术进入全基因组时代，对于基因功能、基因型-表型关联的知识已扩展到非编码区。与已有的分子遗传学知识相结合，例如脆性位点，使新技术带来的新发现能够得到生物学意义解析。这些都为基础和临床研究开辟了巨大的发展空间。
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参考文献：Trost, B., Engchuan, W., Nguyen, C.M. et al. Genome-wide detection of tandem DNA repeats that are expanded in autism. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2579-z
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